用恒溫水浴鍋提取動物組織細胞基因組DNA

更新時間：2019-06-11

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一、儀器及試劑

⒈儀器：

恒溫水浴鍋、臺式離心機、紫外分光光度計（GeneQuant）、移液器、玻璃勻漿器、離心管（滅菌）、吸頭（滅菌）

⒉試劑：

（1）細胞裂解緩沖液：

Tris (pH8.0) 100 mmol/L

EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L

NaCL 20 mmol/L

SDS 10%

胰RNA酶 20ug/ml

（2）蛋白酶K：稱取20mg蛋白酶k溶于1ml滅菌的雙蒸水中，?C20℃備用。

（3）TE緩沖液（pH 8.0）：高壓滅菌，室溫貯存。

（4）酚： CHCl3：異戊醇（25:24:1）

（5）異丙醇、冷無水乙醇、70%乙醇、滅菌水。

二、操作步驟

⒈取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數次。于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上清液入另一離心管中。

⒉加2倍體積異丙醇，倒轉混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進行PCR反應等，需要進一步純化的按下列步驟進行）

⒊加等量的酚? CHCl3?異戊醇振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

⒋取上層溶液至另一管，加入等體積的 CHCl3?異戊醇，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

⒌取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L乙酸氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。

⒍小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

⒎用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。

⒏小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

⒐加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存備用。

⒑吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

三、常見問題

⒈選擇的實驗材料要新鮮，處理時間不易過長。

⒉在加入細胞裂解緩沖液前，細胞必須均勻分散，以減少DNA團塊形成。

⒊提取的DNA不易溶解：不純，含雜質較多；加溶解液太少使濃度過大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。

⒋電泳檢測時DNA成涂布狀：操作不慎；污染核酸酶等。

⒌分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不純，含有蛋白質等雜質。在這種情況下，應加入SDS 至終濃度為0.5%，并重復步驟2～8。

⒍酚/ CHCl3/異戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高濃度的DNA，可加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量。

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