菌種的擴大培養

更新時間：2019-04-02

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種子培養期染菌的危害MAX大，因嚴格防止。一旦發現種子染菌，均應滅菌后棄去，并對種子罐及其管道進行*滅菌。發酵前期養分豐富，容易染菌，此時養分消耗不多，應將發酵液補足必要養分后迅速滅菌，并重新接種發酵。發酵中期染菌不但嚴重干擾生產菌株的代謝，而且會影響產物的生成，甚至使已形成的產物分解。由于發酵中期養分已被大量消耗，代謝產物的生成又不是很多，挽救處理比較困難，可考慮加入適量的抗生素或殺菌劑。如果是發酵后期染菌，此時產物積累已較多，糖等養分已接近耗盡，若染菌不嚴重，可繼續進行發酵;若污染嚴重，可提錢放罐。染菌程度越重，危害越大;染菌少，對發酵的影響就小。所以喆圖小編給大家講講實際生產中，應當根據污染程度和發酵時期區別對待。

1 實驗器材與試劑

1.1 器材

熱空氣消毒箱、超凈工作臺、振蕩培養箱、顯微鏡、天平、三角瓶、試管、移液管、培養皿、接種針、平板涂布器、酒精燈、載玻片

1.2 試劑營養瓊脂、葡萄糖、磷酸二氫氨、七水合硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、C8H9Cl、蛋白胨、0.4%酚紅溶液、蒸餾水、番紅染液、香柏油、擦鏡液

1.3培養基

(1)營養瓊脂培養基：直接稱量營養瓊脂粉4.5g，溶于100mL蒸餾水配制，pH7.2，分裝到試管中，滅菌后擺成斜面。

(2)種子培養基：葡萄糖 0.5%、磷酸二氫氨 0.1%、七水合硫酸鎂 0.02%、氯化鈉 0.5%、磷酸氫二鉀 0.1%

(3)葡萄糖酚紅肉湯培養基：C8H9Cl 0.3%、蛋白胨 0.8%、葡萄糖 0.5%、氯化鈉 0.5%、 0.4% 酚紅溶液，pH7.2

2實驗方法

2.1種子的擴大培養

2.1.1斜面培養基的配制

配制營養瓊脂培養基，分裝，滅菌(121℃條件下滅菌 30min)，倒斜面。

2.1.2菌種的活化

⑴將大腸桿菌采用無菌操作的方法接種于斜面上，恒溫培養箱37 ℃下培養18h;

⑵培養 18h 后，觀察菌落顏色是否一致，若均為黃色，挑取培養皿周邊的菌落進行無菌檢測;若顏色有黃有白，則兩種顏色的菌落均要進行無菌檢測。檢測方法常用染色鏡檢，若檢測后，沒有污染，便可進行擴大培養;若檢測到雜菌，要重復上述步驟，直到無菌為止，否則，不能繼續下一步操作。

2.1.3擴大培養

在無菌條件下，從檢測后的活化培養基上挑取10個左右菌落，用接種針接種到擴大培養基(即種子培養基)中，于37℃下振蕩培16-18h，觀察菌落形態。然后配合顯微鏡形態觀察，根據結果來判斷能否進行下一步。

2.2污染的檢測和判別

2.2.1顯微鏡檢查

⑴取樣：用無菌操作方式取發酵液少許,涂布在載玻片上;

⑵制片、染色：自然風干后,用番紅染液染色 1-2min，水洗;

⑶干燥后用油鏡下觀察。

2.2.2平板檢查

⑴配制營養瓊脂培養基，滅菌，倒平板;

⑵取少量待檢發酵液經稀釋 (大約 10–6～10–7) 后涂布在營養瓊脂平板上，在電熱恒溫培養箱中 37℃下培養 24h;

⑶觀察菌落形態。

2.2.3肉湯培養檢查法(用于檢測培養基滅菌是否*)

將1ml待測液(滅菌處理后的種子培養基)接入葡萄糖酚紅肉湯培養基中，于37℃下培養24h，觀察培養基的狀態和顏色。

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